میکروب‌های داخلی و خارجی زنبور عسل سالم
ترجمه: دكتر سیمین عقیلی، دكتر محمد فرسی
ادارة کل دامپزشکی استان چهار محال و بختیاری سازمان دامپزشكی كشور
در تحقیقات اخیر حدود 8000 گونه میكروب یا میكروبهای مفید در زنبور عسل شناخته شده كه در فعل وانفعالات بدن زنبور عسل شركت دارند. بعضی در هضم مواد همكاری می نمایند، برخی ویتامینها را می سازند، گروهی در عمل آوری گرده نقش داشته و محافظ گرده از فساد هستند، گروهی آنتی بیوتیكها و گروهی ضد قارچها را تولید نموده و در ایمنی زنبور دخالت دارند. باید دانست كه استفاده بی رویه ازآنتی بیوتیكها این میكرو ارگانیسم‌های مفید را از بین برده وزنبور عسل را از مزایای آنها بی بهره می سازد. تحقیق حاضر به بررسی میكروبها و قارچهایی كه در بدن زنبور عسل سالم بطور طبیعی وجود داشته و با زنبور همزیستی دارند می پردازد. در طول دوره گلدهی مركبات و پنبه، میكرو ارگانیسم‌هایی از سطح بدن و بخش‌های داخلی زنبوران سالم جدا شدند. باكتریها و مخمرهای سطح بدن شامل باسیلهای اسپوردار، لاكتو باسیل، میكروكوك، سارسینا، باسیلهای گرم منفی، اكتینو میسس، كاندیدا و ساكارو میسس بودند. باكتریهای اسپور دار غالب بوده و سایرین نسبتاً درصد كمتری داشتند. باكتریهای جدا شده از معده و روده زنبوران كارگر به همان گروههایی كه از سطح بدن جدا شدند تعلق داشتند. باكتریهای اسپوردار در معده غالب، در حالیكه در روده هم باكتریهای اسپور دار و هم لاكتوباسیل‌ها برتری داشتند.
انواع باكتریهای شایع تشخیص داده شدند. هیچ تفاوت معنی داری بین فصل مركبات و پنبه دیده نشد. گزارشات متعدد نشان می‌دهد كه تعدادی از میكروارگانیسم‌ها بطور طبیعی داخل و روی بدن حشرات وجود دارند. اولین بررسی‌ها دال بر وجود میكروارگانیسم‌ها در زنبوران عسل یا در زنبورستان توسط ویشی در سال 1959انجام شده است. این ارگانیسم‌ها بطور كامل توصیف نشده اند. با این وجود اغلب تحقیقات پیشین به میكروارگانیسم‌های بیماریزا مثل لوك اروپایی یا آمریكایی، سپتی سمی و غیره پرداخته اند، فقط چند بررسی راجع به باكتریهای روده زنبور عسل در گذشته انجام شده است. تحقیق حاضر به بررسی میكروارگانیسم‌هایی كه ممکن است در روی بدن و داخل بدن زنبور عسل سالم یافت شوند، پرداخته است.
مواد و روش ها:
در طول فصل گل دهی مركبات (اردیبهشت و خرداد) و پنبه (تیر تا شهریور) زنبوران كارگر در لوله‌های آزمایش استریل در هنگام بازگشت به كندو و حوالی ساعت 11 صبح جمع آوری شدند. این لوله‌ها را در جلوی دریچه پرواز قرار داده وقتی تعداد مناسبی زنبور در آن جمع می شد با یك درب كائوچویی مسدود و فوری به آزمایشگاه انتقال داده می‌شد. در آنجا با یك پنبه آغشته به اتر زنبوران را بی هوش نموده ومنفذ دهانی ومخرج زنبوران با یك مخلوط ذوب شده از موم و وازلین مسدود میگردید.
برای تعیین میكروفلور سطح بدن، هر حشره را در لوله آزمایش حاوی 4سی سی محلول آب نمك نرمال كاملاً تكان داده تا میكروارگانیسم‌ها جدا شوند.
میكروفلور روده و معده زنبوران نیز بررسی گردید. برای این کار حشره را در لوله حاوی1/0 درصد كلرور جیوه بمدت 5 دقیقه بخوبی تكان داده، محلول میکروب کش حاصله راخارج کرده و زنبوران را سه مرتبه با آب مقطر شستشو می دهیم. سپس حشره را داخل پتری دیش قرار داده و قطعات بدنی را با اجتناب از برش اپیتلیوم روده از پهلو، بطور طولی شكاف داده و روده میانی و خلفی را از لوله گوارش جدا نموده و به یك لوله حاوی 4 سی سی آب نمك نرمال منتقل می نماییم. معده را با یک برش از پیش معده و مری جدا نموده، در آب نمك قرار داده می‌شود. روده و همچنین معده را به كمك میله شیشه‌ای در آب نمك بهم زده و بصورت یكنواخت در می آوریم.
ارگانیسم‌ها با روش خالص سازی در پلیت با استفاده از محیط پایه، کشت و جدا سازی میشوند.
محیط پایه (عصاره گوشت گاو 3/0درصد عصاره مخمر 3/0درصد، پپتون 5/0درصد، تریپتون 5/0درصد، عصارةگوجه فرنگی 5درصد، گلوكز 25/0درصد، لاكتوز 25/0درصد، آگار 5/1درصد در آب مقطر و 7=PH )
و محیط آگار عسل ( پپتون 5/0درصد، عصاره گوشت گاو 3/0درصد، عصاره مخمر 3/0درصد، عسل 5/2درصد، آگار 5/1درصد در آب مقطر و 7= PH) برای باكتریها.
و آگار ورت (عصاره گوشت 3/0درصد، پپتون5/0درصد، آگار 5/1درصد در آگار شیرین ورت 10 Balling ).
و آگار عسل (4/5 = PH) برای مخمرها.
بعد از نگهداری در 30 درجه سانتی گراد برای 48 ساعت، كلنی‌ها از دو بخش جداگانه از پلیت‌ها انتخاب شده و در شیر لیتموس كشت داده می‌شود. همه كلنی‌های جدا شده با كشت خطی در پلیت آگار مناسب خالص سازی میشوند.
باكتریها بر حسب شكل سلول، واكنش گرم، هوازی بودن، تولید كاتالاز واكنش با شیر لیتموس و تخمیر دكستروز و سوكروز دسته بندی می شوند.
تیپ‌های باسیلهای اسپوردار بر اساس دستورالعمل برگی در سال1957, لاكتوباسیل‌ها بر اساس دستورالعمل گیبسون و عبدالملك در سال 1945 و میكروکوك‌ها بر اساس دستورالعمل عبدالملك و گیبسون در سال 1948دسته بندی شدند. برای تفكیك قارچها از روش لودر و کریژر 1952 استفاده گردید.
نتایج:
فلور خارجی:
در طول فصول گلدهی مركبات و پنبه به ترتیب تعداد 798 و 518 ارگانیسم از 50 زنبوركارگر در هر فصل جدا وبه شش گروه تقسیم بندی گردیدند.
باسیلهای اسپوردار, میكروكوك ها- سارسینا- لاكتوباسیل‌ها - باكتریهای میله‌ای گرم منفی و اكتینومیس ها. جدول شماره 1، درصد توزیع این گروهها را در دو محیط کشت در زمان گلدهی مركبات و پنبه نشان می‌دهد.
بنظر میرسد كه محیط پایه تعداد باكتری و گروههای باكتریایی بیشتری از محیط عسل(7=( PH را نشان می‌دهد. در همه موارد كلنی‌ها از دو بخش مقابل در پلیت با رقت مشابه برداشته شده و در نتیجه نشانگر نیمی از كلنی‌های رشد یافته می‌باشند. (جدول1)
جدای از فصل، باسیلهای اسپور دار هوازی غالب بودند (83درصد - 67درصد)، میكروكوك‌ها و سارسینا 20درصد -8درصد را تشكیل داده در حالیكه باكتریهای گرم منفی میله‌ای، اكتینومیست‌ها و لاكتوباسیل‌ها درصد كمتری داشتند.
تركیب غالب كشت سطح بدن هر كدام از زنبوران كه به تنهایی كشت داده می‌شد با ارقام موجود تفاوت چندانی نداشت.
تقریباً تعداد مشابهی از مخمرها بعد از غنی سازی در طول دو فصل جدا گردید، تمام موارد جدا شده 142)مورد) به دو نوع كاندیدا و ساكارومیسس‌ها تعلق داشتند.
فلور داخلی:
فلور روده: باكتریهای جدا شده از روده (میانی و خلفی) زنبوران كارگر (50 نمونه زنبور در هر فصل) به گروههای ذیل تعلق داشتند:
باسیلهای اسپوردار، لاكتوباسیل ها,استرپتوكوكسی، میكروكوكسی و باسیلهای گرم منفی(جدول2)
هیچ تفاوت معنی داری بین فصول مركبات و پنبه مشخص نگردید و بطور كلی گروههای غالب در كشت پایه باكتریهای اسپوردار (46-41 درصد ) بودند، سپس لاكتوباسیل‌ها (33- 30درصد )، باكتریهای گرم منفی (17درصد) و استرپتوكوك‌ها ومیكروکوك‌ها گاهی به میزان پایین ظاهر شدند.
در محیط عسل باسیلهای اسپوردار 61-63درصد میكروبهای جدا شده بودند و گروههای دیگر به میزان كم حضور داشتند.
در فصل مركبات و پنبه به ترتیب 115 و 98 سویه مخمر یافت گردید که روی محیط ورت و عسل با 5/4= PH كشت داده شد كه به گروههای كاندیدا و ساكارو میست تعلق داشتند. كاندیدا در طول فصول ذكر شده 77-86درصد كل مخمرها را تشكیل می دادند. (جدول2)
فلور معده: میكروارگانیسم‌ها از معدة 50 زنبوركارگر فقط در طول فصل مركبات جداسازی شد, برای جداسازی باكتریها از محیط پایه (885 تا جدا شده) و برای جداسازی مخمرها از محیط ورت (130 تا جدا شده) استفاده گردید.
باسیلهای اسپوردار مجدداً اغلب باكتریهای جدا شده را تشكیل میدهند (6/61درصد) لاكتوباسیل و استرپتوكوكسی 31 درصد در حالیكه میكرو كوك‌ها اكتینومیست‌ها و باكتریهای گرم منفی همیشه حضور نداشتند و فقط 4/7درصد را تشكیل میدادند
همه مخمرهای جدا شده در معده به دو گونه كه در سطح بدن نیز بودند محدود شده و شامل كاندیدا (63درصد) و ساكارومیسس (37درصد) می‌باشند.
نحوه توزیع میكروارگانیسم ها:
در جدول شماره 3 و 4 نشان داده شده است. توزیع درصدی تیپ‌های مختلف از یك گروهِ معین از كل تعداد جدا شده از دو محیط (پایه و عسل) برآورد گردید و معدل درصد تیپ‌های مخصوص فقط اندكی در دو محیط تفاوت داشتند.
1- باسیلهای اسپوردار هوازی 2- لاكتوباسیل‌ها 3 - میكروكوكسی‌ها 4- باكتریهای گرم منفی
1- باسیلهای اسپوردار هوازی:
سطح بدن:از سطح بدن زنبوران كارگر در طول فصل مركبات 540 نمونه گونه باسیلوس جدا شده و در طول فصل پنبه 418 نمونه که به شش گونه دسته بندی میشوند: سوبتیلیس، سرئوس، بادیوس، پومیلوس، كوآگولانس، و مگاتریوم.
همانگونه كه در جدول 3 نشان داده شده در هر دو فصل باسیلوس سوبتیلیس گونه غالب است كه حدود 72/68درصد باسیلوس‌ها را تشکیل داده است.
باسیلوس سرئوس، بادیوس، پومیلوس، و كوآگولانس در هر دو فصل به میزان محدود مشاهده گردیدند. باسیلوس مگاتریوم در فصل پنبه جدا نگردید و در طول فصل مركبات یك بار و از 540 نمونة جدا شده 10 نمونه باسیلوس مگاتریوم بود كه نشانگر 2درصد كل باكتریهای اسپوردار است.
معده و روده:در طول فصل مركبات، همان گونه‌ها بجز باسیلوس سرئوس و باسیلوس مگاتریوم در معده یافت شدند در حالیكه در روده فقط باسیلوس‌های سوبتیلیس و سرئوس و بادیوس تشخیص داده شدند.
باسیلوس سرئوس در فصل پنبه در روده یافت نشد و فقط باسیلوس‌های سوبتیلیس و بادیوس مشاهده شدند.
همانند سطح بدن باسیلوس سوبتیلیس در معده و روده زنبوران كارگر غالب بود.
2- لاكتوباسیل ها: لاكتوباسیل‌های جدا شده بدو تیپ تخمیر كننده همسان و غیر همسان طبقه بندی شدند.
در سطح بدن زنبوران عسل این دو تیپ كم و بیش برابر بودند. در معده همانند سطح بدن همان دو تیپ یافت گردید اما لاكتوباسیل‌های تخمیر كننده ناهمسان بردیگری برتری داشته در حالیكه در روده لاكتوباسیل‌های همسان غالب بودند. هیچ تفاوتی بین فصول مشاهده نشد. (جدول3)
3- میكروكوك‌ها: همانگونه كه در جدول 4 نشان داده شده در سطح بدن زنبوران میكروكوكهای لوتئوس و واریانس غالب بودند. سایر میكروكوكهای جدا شده شامل استافیلوكوك‌ها و درصد خیلی پایینی از تیپ‌های واسطه ای(2درصد) بودند. در معده و روده میكروكوك واریانس تنها گونه جدا شده در هر دو فصل بود.
4 - باسیلهای گرم منفی:
میزان شیوع گروههای مختلف باسیلهای گرم منفی جدا شده در جدول 4 دیده می‌شود. گروه غالب جدا شده از سطح بدن و روده زنبوران گروه كلی باسیل هوازی بودند. از تیپ‌های دیگر آكروموباكتر و سراتیا تنها تیپ‌هایی بودند كه در سطح بدن زنبوران یافت شدند. درصد اندكی از آلكالیژن‌ها (2درصد ) از روده چند زنبور در فصل پنبه جدا شده.
بحث:
زنبوران عسل با پرواز طولانی برای جمع آوری شهد و گرده گل در معرض میكروارگانیسم‌های مختلف می‌باشند. ساختمان بدنی آنها برای حمل گرده به قدری مناسب طراحی شده که ممكن است موهای سطح بدن حشره ,گونه‌های مختلف میكروارگانیسم‌ها را منتقل نماید. میكروارگانیسم‌های گوناگون شامل باكتریها و مخمرها چسبیده به سطح بدن حشره مشاهده شده اند. اغلب باكتریها را اسپوردارها تشکیل میدادند. تیپ‌های دیگر از جمله میكروبهای میله‌ای گرم مثبت بدون اسپور، فرم‌های كوكسی، گرم منفی‌های میله‌ای كوتاه و اكتینومیست‌ها به میزان نسبتاً كمی حضور داشته، مخمرها به تعداد محدودی دیده شده اند. این نتایج نشان می‌دهد كه تیپ‌های میكروارگانیسم‌های مربوط به زنبور عسل ممكن است اساساً با آنهائیكه در سایر حشرات هستند تفاوت داشته باشد. غیر ممكن است كه دقیقاً تیپ‌های میكروارگانیسم‌های زنبور عسل را در فصول مختلف تعیین نمود، با اینكه عملاً تفاوتی در تیپ‌ها و درصد آنها در طول دو فصل گلدهی مركبات و پنبه مشاهده نشد.
میكرو ارگانیسم‌های جدا شده از سطح بدن زنبوران شامل باسیلوس‌های سوبتیلیس، سرئوس، بادیوس، پومیلوس، كواگولانس، مگاتریوم، سارسینا، میكرو كوك‌ها، لاكتوباسیل ها، استرپتومیسس‌ها، كاندیدا و ساكارو میست‌ها بودند، بعلاوه كلی فرم‌ها و دیگر میكروبهای میله‌ای گرم منفی مشخص گردیدند.
برخی از این میكروارگانیسم‌ها توسط محققین قبلی تشخیص داده شده بودند. جالب است اشاره شود كه همان گروههای میكروفلور و حتی همان گونه‌ها و جنس‌های جدا شده از سطح بدن زنبوران كارگر در معده و روده زنبوران وجود داشتند. باكتریهای اسپوردار غالب در سطح بدن زنبوران و در معده و روده‌ها نشانگر این است كه باكتریهای معمول موجود روی گل‌هایی كه توسط زنبور ملاقات میشوندپیوسته به میزان ثابت داخل دستگاه گوارش وجود داشته چون شهد و گرده تنها منبع غذایی زنبوران می‌باشند.
در روده نه تنها باكتریهای اسپوردار غالب بودند بلكه گونه‌های لاكتوباسیل به میزان قابل توجهی وجود داشتند. این وضعیت احتمالاً بدلیل شرایط ایده‌آل حاكم در روده برای این باكتریهاست. این موضوع با یافته‌های كلوگ 1963 مبنی بر وجود گونه‌های باسیلوس و لاكتوباسیلوس در رودة زنبوران تناسب دارد. بنظر میرسد میزان نسبتاً پایین مخمرهای یافت شده در درون و سطح بدن زنبوران عسل نیز از شهد گلها منشأ بگیرد. از گلهای مختلفی كه توسط زنبور ملاقات می‌شود در سال 1929 مخمرها را جدا كردند. تغذیه منبع تأثیرگذار در فلور میكروبی می‌باشد و بنظر میرسد كه محیط تعیین كننده تیپ‌های میكروارگانیسم‌های موجود در سطح بدن زنبوران عسل و دستگاه گوارش باشد.
منبع:M. A. El-Leithy & K. B. El-Sibaei Egypt. j. Mic. Microflora of Honey Bee